近年来，基于CRISPR系统开发的碱基编辑器可以实现DNA上的精确碱基转换。由于存在gRNA依赖性脱靶和gRNA非依赖性脱靶，早期开发的胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor, CBE）在治疗中可能会存在安全隐患，需要开发更精准的CBE系统用于临床治疗。
上海科技大学陈佳课题组与合作者构建了一种能够消除gRNA依赖性和gRNA非依赖性全基因组脱靶突变以及gRNA非依赖性全转录组水平脱靶突变的高精准变形式碱基编辑器（transformer base editor， tBE）。
在前期工作基础上，上海科技大学陈佳课题组、李剑峰课题组以及复旦大学生物医学研究院杨力课题组在Nature Protocols杂志发表了题为Design and application of the transformer base editor in mammalian cells and mice的实验指南论文，详细介绍了tBE系统的工作原理、设计方案以及体内编辑方法。
该论文首先详细描述了tBE系统的组成元件（图一a）和工作原理（图一 b）。tBE-V5-mA3是由胞苷脱氨酶催化结构域（mA3CDA1）、胞苷脱氨酶抑制结构域（mA3dCDI）、尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂（UGI）和另一种RNA适体结合蛋白（MCP）所组成的效应子融合蛋白；N22p-TEVc是RNA适体结合蛋白（N22p）与TEV蛋白酶的C端片段（TEVc）所组成的融合蛋白（图一a）。
当tBE系统在细胞中表达时，由于mA3dCDI与mA3CDA1之间通过TEV蛋白酶识别位点相融合，mA3CDA1的活性被抑制（图一b）。当nSpCas9-hsgRNA和nSpCas9-sgRNA同时结合到基因组靶向位点时，hsgRNA-MS2招募效应子融合蛋白tBE-V5-mA3，sgRNA-boxB招募N22p-TEVc融合蛋白; 与此同时，游离的TEVn和sgRNA-boxB招募的TEVc会在靶向位点处组成完整的TEV蛋白酶，从而切除与mA3CDA1相连的mA3dCDI，释放mA3CDA1的胞苷脱氨酶活性，产生C-T的碱基编辑（图一b）。
由于tBE 系统中将TEV蛋白酶拆分为无功能的两部分（TEVc, TEVn），可以保证使mA3CDA1活化的三分子反应只发生在靶向位点处（图 一b）。在基因组的其它位置，TEVn、TEVc与TEV蛋白酶识别位点之间的两分子随机反应都不会导致mA3CDA1的脱氨活性被激活（图 一b），从而防止产生脱靶突变。
图一：tBE的元件（a）以及工作原理（b）
该论文随后介绍了sgRNA-hsgRNA pair的设计方案，在利用tBE对目标靶点进行编辑时，sgRNA-hsgRNA pair的位置选择十分关键。在常用细胞系中筛选出目标靶点的最佳sgRNA-hsgRNA pair后，作者对利用双腺相关病毒（Dual-AAV）包装tBE系统并递送至小鼠体内以检测治疗效果的实验方法进行了详述。此外，该文还全面详细地介绍了如何检测基因编辑过程中的gRNA依赖性脱靶、gRNA非依赖性脱靶、gRNA非依赖性全基因脱靶以及gRNA非依赖性全转录组脱靶，并列举了实验方法和数据分析工具。
综上，tBE通过巧妙的设计，利用变形式组装实现无脱靶效应的高效精准型碱基编辑，为疾病的临床诊疗提供了安全高效的新方法和新工具。
该论文中，上海科技大学陈佳教授、复旦大学生物医学研究院杨力教授和上海科技大学李剑峰教授为共同通讯作者，陈佳课题组博士研究生韩炆艳，杨力研究组博士研究生高宝青，陈佳课题组博士研究生朱俊杰，李剑峰课题组硕士研究生何宗兴为共同第一作者。